PCR儀使用方法

PCR儀使用方法 | 時間: March-21 21:30:10 | 分類:技術欄目

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（一）試劑PCR儀
　　（1）引物：決定擴增的特異性。根據檢測的DNA不同，選用不同引物，每種病原微生
　　物都有自己特異的引物。
　　（2）耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細菌中分離出來的，能耐受高溫90℃-100℃。
　　（3）10×PCR緩沖液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl（pH8.4,20℃）150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10×PCR緩沖液隨酶一起購買。
　　（4）5mmol/L dNTP貯備液：將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合并，加入滅菌去離子水溶解，用NaOH調pH至中性，分裝每份300μl，-20℃保存。dNTP濃度較好用UV吸收法精確測定。現用dNTP溶液均有商品化產品。
　　（5）DNA模板：用處理液將待測標本處理，不同處理方法、操作各異，但目的是暴露標本中被檢測的DNA。
　　（二）操作程序PCR儀
　　過去標準的PCR操作程序是將PCR儀必需反應成份分別加入一微量離心管中，然后置于一定的循環參數條件下進行循環擴增。具體如下：
　　（1）向一微量離心管中依次加入
　　DNA模板　　　　　　 102-105拷貝
　　引物　　　　　　　　　 各1μmol/L
　　dNTP　 　　　　　 各200μmol/L
　　10×PCR緩沖液　　1/10體積
　　ddH2O　　　　　補到終體積（終體積50μl-100μl）
　　混勻后，離心15s使反應成分集于管底。以上步驟僅在實驗研究用，現在商品化試劑已將dNTP、10×PCR緩沖液，引物，ddH2O混合在一起，反應體積為20-25μl，只要試驗人員加入處理好的樣品就可以了。
　　（2）加石蠟油50-100μl于反應液表面以防蒸發。置反應管于97℃變性10min。
　　（3）冷至延伸溫度時，加入1-5u Taq DNA聚合酶，離心30s使酶和反應液充分混合。現在臨床使用試劑酶通常已加入反應液中。
　　（4）PCR儀的循環程序為：94℃變性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循環30-35次。較后一次循環結束后，再將反應管置72℃溫育5min，以確保充分延伸。
　　PCR儀尚可用于組織標本DNA的擴增。由于固定組織標本的DNA常發生降解，就給常用的分析方法如Southern轉印雜交等帶來一定困難。87年Impraim等人首先將PCR技術引入固定包埋組織內DNA分析。他們先從組織標本中提取DNA，再用PCR進行特異性的DNA擴增，應用這種方法，他們成功地從保存30至40年之久的組織標本DNA中擴增了HPV病毒基因片段。但這種方法需要提取DNA，操作比較繁瑣。1988年Shibata等人對Impraim的方法進行了改進。他們將固定包埋的組織塊制成5-10um厚，0.4cm大小的切片。將切片放入容積為500μl的Eppendorf管內。加入400μl二甲苯脫脂，離心除去二甲苯，用400μl 95%乙醇洗去殘余二甲苯。離心除盡乙醇、加入100μlPCR反應基質，將Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然后按前述PCR方法進行DNA擴增。
　　在應用PCR方法檢測RNA病毒時，首先應將RNA轉化成cDNA才能進行擴增，因為PCR只能對DNA模板進行擴增，我們把這種RNA的PCR反應稱為反轉錄PCR，簡稱RT-PCR。把由RNA轉化成DNA的過程叫做反轉錄，反轉錄需要在反轉錄酶的作用下完成。

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