四維核酸雜交技術(shù)介紹
四維核酸雜交技術(shù)介紹 | 時(shí)間: January-6 12:56:58 | 分類:技術(shù)欄目
凌儀生物提供高速離心機(jī)，美國(guó)Bio-rad伯樂電泳，德國(guó)eppendorf艾本德移液器，美國(guó)ABI基因擴(kuò)增儀PCR，雅培原位雜交儀，Thermo熱電離心機(jī)等實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備，以及Corning康寧，Axygen愛思進(jìn)，Greiner格瑞拉等耗材要省錢，別錯(cuò)過哦。
定義
四維核酸雜交技術(shù)[ 1 ]（4DH），即在傳統(tǒng)核酸雜交三維空間(XYZ：表征DNA片段的長(zhǎng)度、堿基組成和堿基的排列)的基礎(chǔ)上引入溫度作為第四位參數(shù)所構(gòu)成的四維溫度空間平臺(tái)上建立的核酸雜交技術(shù)。
背景
基因組(genome)是指人類細(xì)胞中所有遺傳信息的總和?；蚪M信息是由脫氧核糖核酸(又稱為DNA)攜帶的?；蚪M的DNA是一種由4種堿基(A,G,C和T)組成的雙鏈聚合體，這種雙鏈結(jié)構(gòu)的每條單鏈核苷酸鏈都以磷酸核糖為骨架，其堿基順序稱作DNA的一級(jí)序列結(jié)構(gòu)?；蚪MDNA的兩條鏈?zhǔn)峭ㄟ^每條鏈上互補(bǔ)堿基間氫鍵的相互作用而連結(jié)在一起的。堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)顯示，A與T相互作用形成兩對(duì)氫鍵（而不與其他任何堿基作用），G與C相互作用形成三對(duì)氫鍵（而不與其他任何堿基作用）。DNA固有的內(nèi)部雙鏈以及堿基對(duì)相互作用的精確性在雜交過程中被利用。雜交是兩條互補(bǔ)的單鏈核苷酸鏈之間形成一條穩(wěn)定的雙股螺旋雙鏈結(jié)構(gòu)的過程。雜交反應(yīng)可以在溶液中兩個(gè)互補(bǔ)單鏈之間發(fā)生，也可以一個(gè)溶液中的單鏈和固定在固相載體上的互補(bǔ)單鏈之間發(fā)生。而DNA芯片分析（或基因芯片分析）是利用了標(biāo)有熒光的單股核苷酸鏈與DNA芯片上的單股序列鏈的雜交反應(yīng)，是一種核酸雜交生物化學(xué)過程，這是DNA芯片（或基因芯片，也稱DNA微陣列或基因微陣列）的原理基礎(chǔ)，也是PCR技術(shù)中引物（寡核苷酸鏈）和樣品靶（核苷酸單鏈）相互作用的基礎(chǔ)。
基因芯片（或稱DNA芯片）技術(shù)是基于堿基互補(bǔ)原理，在固體芯片表面（數(shù)平方厘米）按一定的排列組合陣列集成大量的DNA探針，通過與待測(cè)DNA（或基因）進(jìn)行雜交反應(yīng)，進(jìn)而一次對(duì)大量DNA（或基因）進(jìn)行平行快速分析檢測(cè)的技術(shù)。
PCR技術(shù)是利用人工合成的引物（寡核苷酸鏈）在適當(dāng)退火溫度（或雜交溫度）下與樣品靶（核苷酸單股鏈）雜交后，由聚合酶在引物
由此可見，核酸的雜交反應(yīng)（DNA單股之間稱Southern雜交，DNA和RNA單股之間稱Northern雜交）是核酸分子生物學(xué)和基因診斷技術(shù)的基礎(chǔ)平臺(tái)。
問題
傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為核酸的Southern或Northern雜交是絕對(duì)特異性一對(duì)一堿基配對(duì)的，但是，事實(shí)上并不是如此較好的。當(dāng)雜交溫度有偏差時(shí)，錯(cuò)配一、二個(gè)堿基或簡(jiǎn)并能態(tài)的情況同樣可以形成寡核苷酸雜交對(duì)。
開發(fā)PCR試劑盒都是用純凈單一序列的核酸鏈經(jīng)優(yōu)化過程而得出，當(dāng)遇到包羅萬(wàn)象的臨床樣品時(shí)，由于提取的核酸往往是總核酸，其中只要有與引物探針是同源序列、近源序列（錯(cuò)一、二個(gè)堿基）或簡(jiǎn)并能態(tài)的部分，就有可能出非特異的假陽(yáng)性信號(hào)。
基因芯片技術(shù)是繼PCR技術(shù)之后又一個(gè)與基因相關(guān)的熱門技術(shù)。基因芯片技術(shù)已經(jīng)發(fā)展十幾年，但是，一直無(wú)法上臨床。為什么？用臨床診斷檢驗(yàn)員的話來(lái)說，再重復(fù)性不好。為什么不好？因?yàn)楝F(xiàn)有基因芯片技術(shù)采用的是傳統(tǒng)雜交——即Southern雜交技術(shù)，即采用的是單一雜交溫度（常用
正是由于傳統(tǒng)雜交存在一定數(shù)量的假陽(yáng)性信號(hào)，也造成在PCR的分析中存在一定數(shù)量假陽(yáng)性信號(hào)，在應(yīng)用傳統(tǒng)雜交的DNA指紋鑒定中也同樣存在一定數(shù)量的假陽(yáng)性信號(hào)。這些缺陷都可以利用四維雜交技術(shù)（4DH）來(lái)克服。
解決方法
由于量子力學(xué)方程式無(wú)解析解，所以沒有準(zhǔn)確公式能夠計(jì)算出DNA片段的熔點(diǎn)溫度值（Tmp），近似估算值往往與實(shí)際值相差懸殊，實(shí)際應(yīng)用中又必須知道準(zhǔn)確值，才能確定較好雜交條件，所以許多廠家和公司開發(fā)產(chǎn)品時(shí)，不得不通過一個(gè)又一個(gè)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)來(lái)獲得較優(yōu)條件。四維雜交技術(shù)是在四維溫度空間里來(lái)考慮基因芯片上各個(gè)DNA探針雜交溫度不一致的問題，采用溫度掃描的辦法，測(cè)量比較各個(gè)點(diǎn)的特征熔點(diǎn)溫度Tmp值，從而給出陰陽(yáng)信號(hào)判定結(jié)果。這也就給出了大規(guī)模測(cè)定寡核苷酸片段熔點(diǎn)溫度(Tmp)的簡(jiǎn)便方法，這無(wú)論是對(duì)科學(xué)研究人員，還是對(duì)診斷試劑廠家，都帶來(lái)了極大的方便和效率。現(xiàn)在的基因診斷試劑都離不開探針和引物（PCR技術(shù)離不開引物，現(xiàn)有全自動(dòng)基因測(cè)序儀離不開引物）——這都是寡核苷酸片段，其熔點(diǎn)溫度(Tmp)對(duì)基因診斷試劑盒是致關(guān)重要的。
采用四維雜交技術(shù)，必須使用四維雜交反應(yīng)試劑[ 2 ]。過去使用的PCR過程結(jié)束后立即進(jìn)行溫度掃描分析熔解曲線的方法，得出的特征熔點(diǎn)溫度Tmp值，單管反應(yīng)過程的再重復(fù)性不好。加入四維雜交反應(yīng)試劑后，結(jié)果穩(wěn)定，單管反應(yīng)過程的再重復(fù)性非常好。而且可以讓PCR的TaqMan探針模式結(jié)果做熔解曲線分析！排除掉假陽(yáng)性信號(hào)。這是因?yàn)橐话?/span>PCR商業(yè)試劑盒反應(yīng)液是針對(duì)聚合酶的特異活性優(yōu)化而來(lái)的較好反應(yīng)條件，這個(gè)較好反應(yīng)只是對(duì)聚合酶的擴(kuò)增反應(yīng)是較優(yōu)化的，對(duì)核酸雜交反應(yīng)不一定是較好反應(yīng)條件！而四維雜交反應(yīng)試劑是針對(duì)核酸雜交反應(yīng)的特異性而進(jìn)行較優(yōu)化后得到的條件，更適合于核酸雜交反應(yīng)。四維雜交反應(yīng)試劑用于基因芯片分析，也可以很好解決傳統(tǒng)雜交基因芯片有關(guān)再重復(fù)性不佳的問題。而依據(jù)相關(guān)專業(yè)設(shè)計(jì)出的四維基因芯片系統(tǒng)可以不用標(biāo)記樣品靶鏈，簡(jiǎn)化了樣品處理，更適合臨床使用。
傳統(tǒng)三維雜交技術(shù)與創(chuàng)新四維雜交技術(shù)之間關(guān)系
如果將核酸雜交技術(shù)比喻成分子生物學(xué)的地基或平臺(tái)，一點(diǎn)也不為過。如果在傳統(tǒng)三維雜交技術(shù)平臺(tái)上建筑分子生物學(xué)房子，就好象在沙灘上建房子，蓋一層平房甚至二三層樓，可能都是不會(huì)有問題。但是，要蓋分子生物學(xué)摩天大廈時(shí)就不能建立在沙灘這樣的地基上（否則要癱塌），而要建立在堅(jiān)實(shí)的巖石地基上。四維雜交技術(shù)就是建筑分子生物學(xué)摩天大廈所需要的堅(jiān)實(shí)巖石地基！傳統(tǒng)三維雜交技術(shù)只是四維雜交技術(shù)的一個(gè)特例，但是，四維雜交技術(shù)的再重復(fù)性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)三維雜交技術(shù)。這里指的再重復(fù)性是指不同時(shí)間之間的重復(fù)性、不同地點(diǎn)之間的重復(fù)性、不同操作者之間的重復(fù)性和不同種類反應(yīng)之間的重復(fù)性，而不是單指同一時(shí)間、同一地點(diǎn)、同一操作者和同一種反應(yīng)之間的可重復(fù)性，即此處指的再重復(fù)性是指客觀規(guī)律的可重復(fù)性。這就是四維雜交技術(shù)的學(xué)術(shù)和商業(yè)價(jià)值！一項(xiàng)技術(shù)是否成熟，其結(jié)果的再重復(fù)性是一個(gè)極其重要標(biāo)志。只有實(shí)際使用中結(jié)果的再重復(fù)性非常好，才能將好的科技轉(zhuǎn)化為工業(yè)生產(chǎn)和日常生活中可重復(fù)使用的生產(chǎn)力，造福于人類。
